小鼠免疫球蛋白M(IgM)Elisa試劑盒說(shuō)明書(shū)
本試劑盒僅供研究使用
檢測(cè)范圍：96T
0.1ng/ml - 4ng/ml
使用目的：
本試劑盒用于測(cè)定小鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中免疫球蛋白M(IgM)含量。
實(shí)驗(yàn)原理：
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中小鼠免疫球蛋白M(IgM)水平。用純化的小鼠免疫球蛋白M(IgM)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入免疫球蛋白M(IgM)，再與HRP 標(biāo)記的免疫球蛋白M(IgM)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的免疫球蛋白M(IgM)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD 值)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中小鼠免疫球蛋白M(IgM)濃度。
試劑盒組成：
1、30倍濃縮洗滌液20ml×1瓶7終止液6ml×1瓶
2、酶標(biāo)試劑6ml×1瓶8標(biāo)準(zhǔn)品(8ng/ml)0.5ml×1瓶
3、酶標(biāo)包被板12孔×8條9標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml×1瓶
4、樣品稀釋液6ml×1瓶10說(shuō)明書(shū)1份
5、顯色劑A液6ml×1瓶11封板膜2張
6、顯色劑B液6ml×1瓶12密封袋1個(gè)
標(biāo)本要求：
1．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融
2．不能檢測(cè)含NaN3 的樣品，因NaN3 抑制辣根過(guò)氧化物酶的(HRP)活性。
操作步驟：
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋?zhuān)罕驹噭┖刑峁┰稑?biāo)準(zhǔn)品一支，用戶(hù)可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。
4ng/ml5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
2ng/ml4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
1ng/ml3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0.5ng/ml2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0.25ng/ml1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
2. 加樣：分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡
量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。
11. 測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD 值)。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行。
操作程序總結(jié)：
計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
注意事項(xiàng)：
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。
3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間最好控制在5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4．請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高(樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的OD值)，請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物請(qǐng)避光保存。
7．嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
9．本試劑不同批號(hào)組分不得混用。
10. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。
保存條件及有效期：
1．試劑盒保存：2-8℃。
2．有效期：6 個(gè)月
