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如何設(shè)定抗體實(shí)驗中各種樣品選擇的條件：
一、如何選擇合適的一抗
請先確定您要檢測的種屬和使用的實(shí)驗方法，然后查找相關(guān)產(chǎn)品，根據(jù)說明書上描述的“適用種屬和實(shí)驗方法”來確定合適的抗體。如果說明書中有明確您要檢測的種屬和實(shí)驗方法均經(jīng)過檢測，則您可以放心地購買該產(chǎn)品。
二、如何選擇合適的二抗
二抗的選擇原則：
針對一抗Ig亞型的(比如一抗是IgM，二抗就要是抗IgM的抗體)
針對一抗來源的二抗(比如一抗是小鼠來源的，二抗就要是抗小鼠的)
為了增加特異性、降低背景：可以選擇Fab段的抗體(去除Fc段的)、經(jīng)過標(biāo)本來源種屬血清吸附的的二抗
查看二抗的說明書，選擇經(jīng)過驗證可以用于相應(yīng)實(shí)驗方法的二抗
三、如何確定一抗的稀釋比例
如果說明書中有推薦的稀釋比例，請按照該稀釋比例進(jìn)行實(shí)驗。但是由于標(biāo)本類型、實(shí)驗條件、操作環(huán)境等各種因素的影響，推薦濃度僅作為參考。實(shí)驗者需要在推薦濃度周圍進(jìn)行多個濃度梯度的實(shí)驗，從中發(fā)現(xiàn)最佳的稀釋比例。
如果說明書沒有推薦稀釋比例，僅注明“Useatanassaydependentdilution”，就需要做大量的預(yù)實(shí)驗來摸索最佳的比例了。 下表列出的純化抗體抗體用于不同實(shí)驗方法時常用的工作濃度，可以作為預(yù)實(shí)驗的參考。未純化的抗體一般在說明書中不會標(biāo)明抗體的濃度，因為大部分全抗血清、 培養(yǎng)上清或腹水形式的產(chǎn)品濃度都是沒有經(jīng)過測定的。如果未純化抗體產(chǎn)品的說明書中沒有標(biāo)明其中特異性抗體的濃度，實(shí)驗者可以參考下表中“估計濃度”確定各 種實(shí)驗稀釋比例。
四、如何選擇同型對照
同型對照的主要目的是確定一抗的結(jié)合是特異性的，而不是非特異性的Fc受體或與其他蛋白的相互作用。同型對照要與一抗的來源、Ig分型和標(biāo)記完全一 致。例如：一抗是FITC標(biāo)記，其抗體分型是小鼠的IgG1，則同型對照要選擇是FITC標(biāo)記的小鼠的IgG1。這里如同使用流式抗體一樣，同樣的不可離 開說明書！
多抗的同型對照：
絕大部分的同型對照產(chǎn)品都是單克隆抗體，因此不適用于作為多克隆抗體的對照(因為多抗含有多種IgG的亞型)。
五、如何選擇陽性對照
陽性對照的使用是一個實(shí)驗中確定抗體及檢測系統(tǒng)是否正常工作的依據(jù)，也是確定待測標(biāo)本中是否存在待測蛋白的一個依據(jù)！尤其是檢測的標(biāo)本是不確定是否有待測蛋白表達(dá)時。因此當(dāng)實(shí)驗沒有陽性結(jié)果出現(xiàn)時，最好的選擇是實(shí)驗合適的陽性對照。
說明書上都有推薦的陽性對照。但是如果說明書上沒有推薦時，請參考以下條款：
看看說明書中是否有Abreviews。任何被其他客戶成功檢測的組織、細(xì)胞或者裂解物均可以作為合適的陽性對照！
根據(jù)說明書上的Swiss-Prot或Omnigene數(shù)據(jù)庫來查找。這些數(shù)據(jù)庫經(jīng)常會列出該蛋白表達(dá)的組織，這也可以作為合適的陽性對照！
