peprotech細(xì)胞因子所需試劑
1、細(xì)胞表面染色的熒光標(biāo)記的單抗試劑
依據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇特殊表面標(biāo)志
CD45圈定所有淋巴細(xì)胞
CD3 圈定T淋巴細(xì)胞
CD4 圈定T輔助淋巴細(xì)胞亞群
CD8 圈定T抑制淋巴細(xì)胞亞群
CD19/或CD20圈定B淋巴細(xì)胞
CD56圈定NK淋巴細(xì)胞
CD14圈定單核細(xì)胞
2、熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體
R&D提供FITC、PE和APC標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體
3、溶血素
用外周全血檢測(cè)時(shí)需使用溶血素（R&D目錄號(hào)WL1000用于人或者WL2000用于小鼠；eBioscience目錄號(hào)00-4333）溶解紅細(xì)胞
4、激活劑
① Phorbol 12-Myristate 13 Acetate（PMA）（Alexis，目錄號(hào)ALX-445-004-M001）
DMSO中調(diào)節(jié)濃度0.1mg/mL
分裝（20L），－20℃儲(chǔ)存。勿反復(fù)凍融
每次實(shí)驗(yàn)用無菌無疊氮鈉PBS 1：100稀釋儲(chǔ)存液
D.PMA終濃度25ng/mL細(xì)胞懸液
② Ionomycin （Alexis，目錄號(hào)ALX-450-006-M001）
于乙醇中配制成濃度0.5mg/mL
－20℃儲(chǔ)存
每次實(shí)驗(yàn)用無菌無疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲(chǔ)存液
③Ionomycin終濃度1g/mL細(xì)胞懸液
Staphylococcal enterotoxin B（SEB） （Sigma，Catalog No.S-4881）
無菌無疊氮鈉PBS調(diào)節(jié)濃度0.5mg/mL
4℃儲(chǔ)存
SEB終濃度10g/mL細(xì)胞懸液
④ CD3：包被在培養(yǎng)板中，在蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑存在下活化未稀釋的血液細(xì)胞
⑤ CD28：加速不同刺激劑（包括SEB、CD3等）的活化效應(yīng)，濃度一般為10ug/ml
5、阻斷劑
阻斷高爾基體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)作用，使得刺激細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子聚集在胞漿內(nèi)
① Brefeldin-A（BFA） （eBioscience，目錄號(hào)00-4506）
于DMSO中調(diào)節(jié)濃度5mg/mL
分裝（20L），-20℃儲(chǔ)存。勿反復(fù)凍融。
每次實(shí)驗(yàn)用無菌無疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲(chǔ)存液
激活最后4－5小時(shí)BFA終濃度10g/mL細(xì)胞懸液。
注意：BFA過度孵育會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活力下降
② Monensin （eBioscience，目錄號(hào)00-4505）
6、 不含谷氨酰胺的RPMI-1640
7、 固定劑
細(xì)胞在體外刺激后需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定。固定的目的在于通過蛋白的交聯(lián)和變性一方面使細(xì)胞因子固定在細(xì)胞內(nèi)，另一方面避免細(xì)胞表面抗原丟失。含4%的多聚甲醛PBS溶液（eBioscience，目錄號(hào)00-8222）
8、 破膜劑
含1%皂甙、0.05%疊氮化鈉的Hanks溶液（HBBS）（eBioscience，目錄號(hào)00-8333）
將細(xì)胞膜穿孔，已利于熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，于相應(yīng)的細(xì)胞因子結(jié)合
9、其它試劑
無菌無疊氮鈉PBS，乙醇，含1%多聚甲醛的PBS，4℃儲(chǔ)存。
