ELISA檢測篩選到的靶分子結(jié)合肽
【ELISA試劑盒材料和試劑】
（1）酶標板，酶標儀
�。�2）濕盒
（3）吸水紙
�。�4）LB培養(yǎng)基
�。�5）PEG/NaCl
（6）TBS
�。�7）0。1M NaHCO3（pH 8。6）
�。�8）HRP底物緩沖液
ABTS貯存液：在100ml 50mM的檸檬酸鈉溶液（pH 4。0）中溶解22mgABTS，過濾除菌貯存在4℃。
【ELISA試劑盒操作步驟】
�。�1）噬斑擴增上清部分用于DNA序列測定，其余保存于4℃。
�。�2）將ER2537接種至20ml LB培養(yǎng)基中，37℃孵育至輕微混濁，或?qū)⑦^夜培養(yǎng)的ER2537按1：100稀釋至20ml。
�。�3）加入5ml噬菌體上清，37℃劇烈通氣培養(yǎng)4。5h。
�。�4）將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入離心管，10，000轉(zhuǎn)離心10min。取上清轉(zhuǎn)入新的離心管，再次離心。
�。�5）吸取上層80%的上清轉(zhuǎn)入新離心管中，加入1/6體積的PEG/NaCl，4℃沉淀1h或過夜。
�。�6）4℃，10，000轉(zhuǎn)離心PEG沉淀物15min。傾去上清，再次短暫離心，吸去殘留上清。
�。�7）用1ml TBS懸浮沉淀物，并轉(zhuǎn)至微量離心管中，4℃離心5min以沉淀殘留細胞。
�。�8）將上清轉(zhuǎn)至新離心管中，再次用1/6體積的PEG/NaCl沉淀噬菌體。冰上孵育15~60min，4℃離心10min。傾去上清，再次短暫離心，吸去殘留上清。
（9）用50ml TBS懸浮沉淀物。測定滴度，貯存于4℃。
�。�10）取100~200ml溶于0。1M NaHCO3（pH 8。6）的100mg/ml靶蛋白包被酶標板的加樣孔，在密封的濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。每一個克隆包被一列。
（11）傾去靶溶液，并將板子反扣在吸水紙上盡量吸干。在每一個孔中加滿封閉緩沖液。另外，每個克隆都需要封閉一列未包被的加樣孔，以檢測其與BSA包被板子的結(jié)合。封閉另一個酶標板用來稀釋噬菌體，這樣可以保證稀釋過程中噬菌體不被靶蛋白吸收。4℃封閉1~2h。
�。�12）傾去封閉液，用1′TBS/Tween洗滌板子6次，每次都將酶標板反扣在吸水紙上盡量吸干。Tween的濃度應(yīng)該與篩選洗滌步驟的濃度相同。
�。�13）用TBS/Tween 4倍比稀釋噬菌體，200ml/孔，第一孔為1012顆粒，第十二孔為2′105顆粒。
�。�14）用多道加樣槍，將每一列倍比稀釋的噬菌體轉(zhuǎn)至靶蛋白包被的酶標板內(nèi)。室溫振蕩孵育1~2h。
�。�15）用1′TBS/Tween洗板6次。
（16）用封閉緩沖液稀釋HRP標記的抗M13抗體，稀釋度為1：5000，每孔加入200ml，室溫振蕩孵育1h。
�。�17）用1′TBS/Tween洗板6次。
�。�18）制備HRP底物緩沖液。ABTS貯存液：在100ml 50mM的檸檬酸鈉溶液（pH 4。0）中溶解22mgABTS，過濾除菌貯存在4℃。使用液要新鮮配制，在21ml ABTS貯存液中加入36ml 30%H2O2，用于一個酶標板。
（19）每孔加入200ml底物緩沖液，室溫孵育10~60min。
（20）酶標儀檢測405~415nm處的OD值。
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